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传统的内质网蛋白提取方法需要采用较高的离心力或者采用密度梯度离心，对实验室离心机设备要求较高，对实验的操作细致程度要求较高。如果实验室没有能达到50000×g以上的离心力的设备，则没法进行提取。
植物内质网膜蛋白提取试剂盒(低速离心法)只需要达到20000×g以内的离心力即可提取内质网膜蛋白，一般的常规台式离心机均可以满足使用要求。
本产品用简便快速的方法可以从各种植物样本中提取内质网膜蛋白，提取过程简单方便，可快速提取得到高质量的内质网膜蛋白。
本产品含有的独特配方能有效溶解膜组份。含有的蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高质量的蛋白提供了保证。
本产品提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白。可用于WB、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、酶活性测定等下游蛋白研究实验。
本产品不含有EDTA，与金属螯和层析等下游应用兼容。
本产品提取的蛋白样本含有高浓度盐成分，不可直接用于2D电泳，需要除盐后再用于2D电泳。如下游实验需直接用于等电聚焦、双向电泳，请使用我公司其他货号的蛋白提取试剂盒。也可以将最后样品除盐后再用于2D电泳，用脱盐柱脱盐处理(相关产品HR0389)。
本产品采用非酶法提取，提取过程简单方便，速度快，但是蛋白回收率和纯度相比酶法较低。酶法提取制备的蛋白纯度高，保持天然活性，而且绝少交叉污染，但是耗时较长。如果需要更加快捷的提取试剂盒，可以选择非酶法的提取试剂盒，对提取速度没有要求的话，可以选择酶法提取试剂盒(相关产品HR9076)。


● 使用方便，从细胞，组织中提取蛋白不需经研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。
● 提取过程简单方便，不需要大型离心机设备。
● 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
● 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
● 总蛋白提取液含多种有效成分，可以充分释放胞浆蛋白、核蛋白和膜蛋白，又可结合释出的蛋白防止沉淀。
● 蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂AEBSF、Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A、Bestatin、E-64，每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。
试剂盒以外自备仪器和试剂耗材：
● 离心机● 振荡器● 匀浆机/Dounce匀浆器● 涡旋混匀器● 100μm细胞筛● PBS ● 蛋白定量试剂盒

试剂盒组成：

组份	50T	100T
组份A：植物内质网膜蛋白提取液A	100mL	200mL
组份B：植物内质网蛋白提取液B	25mL	50mL
组份C：植物内质网蛋白提取液C	25mL	50mL
组份D：膜蛋白提取液D	10mL	20mL
组份E：蛋白酶抑制剂混合物	250μL	500μL

蛋白提取液2～8℃保存；蛋白酶抑制剂-20℃保存。有效期1年。
注：
● 蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2～8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
● 蛋白酶抑制剂在2～8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。


● 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
● 蛋白酶抑制剂在2～8℃时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
● 最好使用Dounce匀浆器匀浆，如果没有Dounce匀浆器，也可用普通玻璃匀浆器匀浆，但是内质网蛋白回收率会下降。
● 提取液A在使用前须一直置于2～8℃，否则下游膜蛋白提取时会导致不容易分层。
● 膜蛋白电泳时Loading buffer应该避免煮沸。
● 膜蛋白电泳时可以提高Loading buffer的SDS含量。


1.试剂配制：
每500μL冷的蛋白提取液C中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
每500μL膜蛋白溶解液D中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
注：
● 根据需要的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂不可一次全部加入提取液。
● 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未用完，再次用前需再次加入蛋白酶抑制剂。
● 蛋白样品用于测定某些细胞内蛋白酶、磷酸酶活性等下游实验时，注意根据实际情况调整抑制剂混合物是否加入。
● 提取液A在使用前须一直置于2～8℃，否则下游膜蛋白提取时会导致不容易分层。
● 以下步骤中使用的蛋白提取液为此步配制好的含蛋白酶抑制剂的提取液。
2.取1g新鲜植物样本叶片，洗净擦干后去除叶梗和粗脉。用手术剪刀尽可能剪碎。
3.加入2mL提取液A后用匀浆机充分匀浆或者加适量提取液A后用Dounce匀浆器充分匀浆。
注：
● 培养细胞直接收集细胞后用Dounce匀浆器匀浆即可，匀浆后加提取液混匀后直接进行后续离心。
● 没有Dounce匀浆器也可置于研钵用液氮研磨，研磨后假如提取液A。
● 没有液氮研磨条件也可加入提取液A后直接置冰上研磨。
4.将匀浆用100μm细胞筛过滤；
注：
● 没有细胞筛网的话可以将滤液静置片刻，让大的组织块自然沉降，收集细胞上清。
● 如果匀浆液较粘稠，不好吸取，可以将吸头尖剪掉一点。
5.将滤液置振荡器轻微振荡20～30分钟。
6.将滤液700×g离心10分钟。弃沉淀，取上清。
7.将上清在3000×g力离心10分钟。弃沉淀，取上清。
8.将上清在12000～20000×g力离心10分钟。弃沉淀，取上清。
注：
● 此处离心力采用实验室离心机能达到的20000×g以内的最大离心力。
9.在上清中加入500μL试剂B，充分混匀。。
10.置2～8℃冰箱静置过夜。
注：
● 静置保存时间不少于10小时。
11.在4℃条件下，10000×g离心20～45分钟。
12.小心移除上清，收集沉淀。
注：
● 尽可能吸干上清。
● 吸取时小心，防止吸掉沉淀。
13.在沉淀中加入500μL冷的蛋白提取液C，充分混匀。
14.充分混匀后在4℃条件下振荡30分钟～1小时。
注：
● 此步骤必须在2～8℃条件振荡。
● 使用振荡器/摇床的较低转速，提取液能轻微晃动即可。
● 没有2～8℃振荡条件也可以不振荡，置2～8℃静置，稍微延长提取液的处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀即可。
15.在4℃，12000×g条件下离心5分钟。取上清。
16.将上清吸入另一干净离心管，在37℃水浴或气浴5～15分钟。
17.在37℃，1000×g力离心5分钟。
注：
● 此步骤必须在37℃条件下离心。
● 无37℃离心条件也可不离心，稍微延长37℃水浴时间，至液体澄清，分层清晰。
18.此时溶液分为两层，下层是内质网膜蛋白约为30～50μL。
19.小心移除上层，保留下层溶液，大约30～50μL液体。
注：
● 下层为粘稠状液体。
20.用150～200μL冷试剂D膜蛋白溶解液溶解下层膜蛋白部分，即得内质网膜蛋白。
注：
● 膜蛋白比较难溶解，不能很快溶解混匀，可以在加入溶解液后稍微吹打混匀，然后置于4℃冰箱静置至溶解。中途用移液器轻轻吹打混匀一次。静置后取出再次用移液器稍微吹打混匀即可。
● 静置直至管底透明胶状物完全溶解。
21.将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或调整相应的浓度后直接用于下游实验。
注：
● 建议用BCA法进行蛋白定量。
● 蛋白样品-80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。


● 蛋白浓度低？
膜蛋白丰度比较低，在条件允许的情况下，需要尽可能加大细胞的上样量以提高膜蛋白浓度。
处理部分样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂AC的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
● 用什么方法定量蛋白？
建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂C中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
● 提取的蛋白具有活性吗？
本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。
● 膜蛋白电泳没有条带？
膜蛋白样品通常浓度较低，电泳前一定要进行蛋白定量，以保证电泳是蛋白上样量足够。
膜蛋白提取好后，用溶解液充分溶解后，可以超声处理一下，再进行蛋白定量。
蛋白加Loading buffer后可以不用煮沸，采用50℃保温30分钟。
蛋白Loading buffer中SDS终浓度含量可以提高至3%～10%。
有些样品的膜蛋白含量太低，可以使用丙酮沉淀膜蛋白，再使膜蛋白溶解于上样缓冲液中，一般可以跑出清晰的蛋白条带。电泳时最好采用低电压低电流电泳。
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